研究人員請 28 個團隊設計 12,000 種可能辨識 CD20 的短蛋白；CD20 是某些癌細胞表面的標記。他們沒有只根據孤立蛋白能否結合 CD20 來評判這些設計，而是採用Bits to Binders 研究將每條 80 個胺基酸的序列放入嵌合抗原受體（CAR），並篩選人體 T 細胞的反應。開放取用論文刊於 Molecular Systems Biology，日期為 10 月 8 日。

結果在每個步驟都更為有限。混合細胞生長篩選指出，在含 CD20 陽性細胞的條件下，有 707 個設計的富集達到至少兩倍且具統計顯著性。接著研究人員逐一測試十個領先且不重複的設計。七個在目標相關增殖、擴增及細胞激素產生方面高於陰性對照。四個造成的 特異性 CD20 陽性細胞殺傷顯著高於對照。這些是來自一名 T 細胞供者分離樣本的實驗室測量，並非治療能在患者身上奏效的證據。

重大變化

  • 改變了什麼： 一場競賽評估數千種以計算方法設計的 CD20 結合蛋白，將它們作為 CAR 的功能部件放入原代人體 T 細胞，再以個別功能檢測檢查十個領先設計。
  • 方法： 各團隊結合不同的生成、序列設計、結構預測與篩選方法。研究人員將提交序列插入同一 CAR 骨架，在混合樣本中篩選 T 細胞生長，並分別測量選出構築體的多項功能。
  • 為何重要： 這項實驗測試的問題比孤立結合更嚴格：設計出的辨識結構域能否在 T 細胞中表現，並幫助細胞對目標作出反應。混合篩選命中到特異性殺傷的數量下降，顯示每項檢測都必須依其自身所測內容解讀。
  • 仍有哪些不確定： 研究只使用一種 CAR 骨架與一名供者的細胞分離樣本。混合比較本身無法單獨分離 CD20 特異性效應；也沒有在動物或患者身上測試任何設計。

從設計的結合蛋白到細胞反應

CAR 會賦予 T 細胞一種工程化表面受體。朝外的結構域負責辨識目標；受體其餘部分則協助把辨識轉成細胞反應。在結合模型中看似有前景的蛋白，仍可能在必須製造、呈現於細胞表面並由活 T 細胞使用時失敗。這正是競賽要檢驗的落差。

來自 42 個國家的參與者在六週階段提交設計，採用的工作流程各不相同。有些使用 RFdiffusion 或 Chroma 等擴散模型；其他人使用 BindCraft、ColabDesign 和蛋白質語言模型等方法。許多人也使用 ProteinMPNN 提議或擴展序列、以結構預測器評估候選，並採用其他計算篩選。數個團隊從已知抗體結合結構中的 CD20，或 CD20 特異性抗體片段開始。因此，提交的序列來自混合的人工作業與計算流程，而非單一 AI 模型獨立設計出所有成功受體。

研究人員為提交的 80 個胺基酸結構域合成 DNA，並把它們放入同一第二代 CAR 主鏈。每個結構域的序列在工程化 T 細胞混合樣本中充當條碼。他們比較培養兩週後，在含 CD20 陽性的 Raji 細胞與不含這些目標細胞的培養條件下，各條碼的豐度。12,000 個設計中，98.3% 通過 DNA 供應商的品質檢查，但細胞生長後只有 56.8% 達到研究的最低讀取門檻。在此階段失敗或缺失的序列，不能直接算作未能辨識 CD20 的結合蛋白；製造、表現與細胞適存度也會影響篩選流程。

混合篩選發現 707 條序列有顯著的至少兩倍富集，占所有提交的 5.9%；各團隊命中率介於 0.6% 至 38.4%。每種條件使用來自一名供者的三個技術重複。比較的是 Raji 細胞與不含 Raji 細胞，而非 CD20 陽性與其他方面相同、但 CD20 陰性的 Raji 細胞。因此作者提醒，混合結果更直接代表與 Raji 相關的生長訊號，儘管後續結合與個別檢測支持部分候選能辨識 CD20。

十項個別測試改變了解讀

十個領先的不同設計被重製為個別 CAR 構築體。研究人員測量受體表現、T 細胞分裂與擴增、兩種訊號蛋白的產生，以及目標細胞殺傷。七個在目標相關增殖、擴增與細胞激素檢測中高於未編輯 T 細胞的陰性對照。然而，這七個之中有三個未顯示顯著的特異性目標細胞殺傷。

殺傷檢測比較 CD20 陽性 Raji 細胞與 CD20 陰性 K562 細胞。只有四個設計（編號 1506、2383、3494 和 3718）的特異性溶解顯著高於陰性對照。論文也指出，數個設計會背景性殺傷兩種細胞株。這很重要，因為殺死 CD20 陽性細胞本身並不能證明 CAR 能良好區分目標與非目標細胞。在各項功能讀數中，設計出的結合蛋白通常不如研究採用的既有抗體衍生 CAR 對照；其中一項細胞激素測量是論文所報告的例外。

孤立蛋白結合檢測又帶來一項提醒。在該條件下，十個中只有三個對去垢劑溶解的 CD20 顯示明顯結合。作者表示，這項檢測未必能代表結合蛋白呈現在 T 細胞 CAR 上時的行為。反過來說，混合生長訊號不足以證明精確結合或安全的目標選擇性。這些檢測回答的是彼此相關、但範圍較窄的問題。

這項基準能指引什麼

研究也將設計選擇與序列特徵和實驗結果相比較。不同方法之間有廣泛差異，但各團隊混用工具，提交的相關序列數量也不均。作者警告，通常不能把某方法表面上的成功解讀為乾淨的因果比較。他們指出，在這組資料中，常見的結構信心分數幾乎無法預測序列回收與增殖。

在同一資料集中，一些較簡單的序列檢查看來更有用。回溯分析中，針對 DNA 組成、重複序列基序及特定胺基酸模式等特徵的篩選，提高了提交設計中出現目標相關增殖的比例。對這場競賽進行回溯篩選，是分析其失敗方式的一種途徑；但尚未證明在新的前瞻性設計輪次中能有同樣改善。

這項研究直接貢獻的是一個開放實驗基準，連結設計選擇與多種細胞層級結果。它有明顯限制：一名供者的細胞分離樣本、一種 CAR 骨架、特異性比較並不完善的混合檢測，以及個別測試中的背景殺傷。作者明確表示，這場競賽旨在治療情境中評估設計方法，而非製造可直接進入臨床的 CAR-T 療法。

來源與延伸閱讀